Методика окрашивания гематоксилин-эозином. Приготовление растворов гематоксилина и эозина. Методика окрашивания срезов гематоксилин - эозином. Гематоксилин Эрлиха. Контрастирование (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г
Методика контрастирования (окраски) парафиновых срезов Гематоксилином и эозином (г.-э)
1) Парафиновые срезы, наклеенные на предметные стёкла, освобождают от парафина (депарафинизируют) поочерёдно погружая их в 2 Порции ксилола (толуола, бензола) – По 3 мин.
2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации (96º, 80º, 60º, 40º, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин .
3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.
4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затеи всполаскивают в дистиллированной воде.
5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.
6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.
7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации – поочерёдно в спирты 40º, 60º, 80º, 96º, и 100º – По 1-2 мин.
8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем - в двух порциях ксилола – по 2 мин .
9) Заключение срезов: на срез стеклянной палочкой наносят маленькую каплю раствора канадского бальзама (полистирола, дамар-лака и др.) и накрывают обезжиренным покровным стеклом, осторожно опуская его под углом, стремясь избежать попадания пузырьков воздуха. Сверху можно поместить небольшой грузик для удаления избытка бальзама (полистирола).
Оценка результатов окрашивания
Гематоксилин является щелочным (основным) красителем. Он окрашивает структуры клеток и тканей, имеющие кислую среду, например, ДНК и РНК в ядрах клеток, кислые гликозаминогликаны в межклеточном веществе соединительной ткани. Поэтому такие структуры называются Базофильными (от лат. Basis – основание). В окрашенном гематоксилином микропрепарате ядра клеток будут тёмно-синими или тёмно-фиолетовыми.
Эозин (от греч. заря) имеет красный или розовый цвет и является кислым красителем. Поэтому окрашивающиеся им щелочные компоненты клеток или неклеточных структур называются Оксифильными, Или ацидофильными (от греч. Oxy Или лат. Acidum – кислота), Или эозинофильными .
Следует учесть, что цитоплазма разных клеток может окрашиваться как базофильно, так и эозинофильно. Например, клетки, активно синтезирующие белковые компоненты, содержат в цитоплазме большое количество рибосом (а, следовательно, и РНК), поэтому их цитоплазма окрашивается Базофильно . Если структуры цитоплазмы окрашиваются одновременно и основными, и кислыми красителями, то они называются Нейтрофильными , или Гетерофильными .
Есть целый ряд красителей, например тиазинового ряда (азур, толуидиновый синий, метиленовый синий и др.), которые при взаимодействии с компонентами клеток и тканей изменяют свой цвет на им несвойственный (синий на красный или фиолетовый; чёрный на жёлтый или зелёный и т. д.). Такое явление получило название Метахромазия.
При соблюдении правил приготовления микропрепаратов и применении стойких красителей постоянные микропрепараты Могут сохраняться десятилетиями, не утрачивая своих первоначальных качеств.
Следует помнить , что ядерные и цитоплазменные красители обычно связываются с окрашиваемыми структурами в количествах, пропорциональных содержанию в них реагирующих компонентов. На этом основана Количественная цито - И гистохимия.
Орсеин
Эта гистологическая окраска используется для выявления эластиновых волокон, особенно это актуально в патологической анатомии кровеносных сосудов. Этот краситель добывается из нескольких видов лишайников. На снимке ниже представлены эластиновые мембраны аорты - самого крупного сосуда тела человека, функция которого заключается смягчить, мощную «ударную волну» сердечного сокращения и провести поток крови к более мелким ветвям. Аорта относится к сосудам эластического типа, так как в ее стенке содержится множество таких эластиновых мембран, куда больше чем в артериях других типов.
Автор фотографии: уточняется
Источник: University of Tasmania. School of Medicine secure.health.utas.edu.au
Осмия тетрооксид (Оксид осмия(VIII))
Другая окраска на жироподобные вещества, хотя сейчас, чаще используется как фиксатор для приготовления препаратов для электронной микроскопии. Он связывает ненасыщенные липиды (в области двойных связей) и, таким образом ткани с большим количеством полиненасыщенных жиров окрасятся в черный цвет. На снимке ниже - отличный пример поперечный срез нервного волокна. Черные кружки - отдельные аксоны с их оболочкой, которая богата миелином - веществом, являющегося своего рода изолятором для нервного волокна, и способствующего распространению нервного импульса, а также очень охотно связывающим высший оксид осмия.
Автор фотографии: уточняется
Источник:vetmed.vt.edu
Изображение изстатьиHistopathologic Changes in Growth-Plate Cartilage Following Ischemic Necrosis of the Capital Femoral Epiphysis An Experimental Investigation in Immature Pigs
. Harry K.W. Kim
, MD, FRCS(C); Phi-Huynh Su
, BSc; Yu-Shan Qiu
, MD
,
опубликованной в
J Bone Joint Surg Am
, 2001 May;83(5):688-697
Источник:jbjs.org
Окраска по Фон Косса (von Kossa)
Эта окраска используется для исследования степени минерализации ткани, то есть выявления выпавших в ткани нерастворимых фосфатов. Принцип окраски заключается в преципитации ионов серебра в кислой среде. Фотохимический распад образующихся фосфатов серебра до металлического серебра, происходящий под воздействием света (процесс, по своей сути, аналогичен таковому происходящему при печати фотографий) позволяет выявить наличие в ткани фосфатов, (чаще всего именно фосфатов кальция), но окраска выявляет лишь присутствие фосфатов, а не кальция самого по себе. Для выявления солей кальция требуются другие окраски, например, уже описанный, ализарин красный. Цветовая схема при этой окраске следующая: фосфаты кальция в массивных депозитах - черного цвета, в мелкодисперсных отложениях - серого. Клеточные ядра - красные, а цитоплазма клеток - светло-розового цвета.
Автор фотографии: уточняется
Источник:iupui.edu
Окраска берлинской лазурью
Она же железная лазурь, прусский синий, парижская лазурь, прусская лазурь, гамбургская синь, нейблау, в гистологии же известна как реакция Перлса. Этот метод очень распространен в гистологии для выявления в тканях соединений железа (например, при диагностике гемохроматозов и выявления гемосидероза - состояний при которых в тканях, по тем или иным причинам, накапливается избыток соединений железа, что, в конечном счете, приводит к недостаточности внутренних органов). Но, что интересно, здесь используется не готовый пигмент для окраски, а образование пигмента в этом случае, происходит непосредственно в срезе ткани и его образование, связанное с присутствием соединений железа, расценивается как положительная реакция.
Оригинальная методика окраски, описанная в 1867 году как «берлинская лазурь Перлса» названа в честь ее автора - германского патолога Макса Перлса (Max Perls) (1843-1881), использовавшего растворы гексацианоферрата (II) калия и соляной кислоты. Депозиты соединений железа в тканях под действием этих растворов образуют собственно берлинскую лазурь, гранулы которой, цвета разных оттенков синего, видны в препарате под микроскопом.
Макрофаги нагруженные железосодержащим пигментом гемосидерином в печени мыши. Селезенка является своего рода "кладбищем для эритроцитов" здесь эритроциты отслужившие свой век (это около 120 дней) задерживаются и разрушаются, а из пигмента гемоглобина извлекается "железо" и используется для синтеза новых молекул кислородсвязывающего белка - гемоглобина.
Автор фотографии: уточняется
Источник: iupui.edu
Срез ткани легкого со скоплениями макрофагов нагруженных гемосидерином. Такие скопления появляются при хронической "застойной" левожелудочковой сердечной недостаточности, когда в системе легочной артерии поднимается давление, из-за того что сердце не может "перекачать" кровь из малого в большой круг кровобращения. Когда давление в ветвях легочной артерии повышено, в полоси альвеол так или иначе начинают проникать эритроциты, они фагоцитируются альвеолярными макрофагами в цитоплазме которых, со временем, накапливается бурый железосодержащий пигмент - гемосидерин, когда таких клеток становится достаточно много (при прогрессирующей сердечной недосточности) они начинают выделятся с мокротой, которая приобретает ржавый оттенок, в такой мокроте при микроскопии можно выявить эти альвеолярные макрофаги, наполненные гемосидерином, их иногда называют клетками сердечных пороков, так как такая степень сердечной недостаточности особенно часто наблюдается при пороках сердца, хотя они также встречаются и при легочных кровотечениях и инфарктах легкого.
Автор фотографии: Yale Rosen
Источник: flickr.com/photos/pulmonary_pathology
Пикросириус красный
Применяется для селективного выявления коллагена I и III типа. Окрашенные по этому методу препараты могут быть исследованы как при помощи стандартной светлопольной световой микроскопии, тогда коллагеновые волокна будут окрашены в ярко-красный цвет, на бледно-желтом фоне, а клеточные ядра, в идеале, - черного цвета, но также могут быть серые или коричневые.
Изображение из статьи “Salt Induces Myocardial and Renal Fibrosis in Normotensive and Hypertensive Rats ”. Henry C. M
. Yu
, MBChB, MRCP, FRACP, FHKCP; Louise M. Burrell
, MBChB, MD, FRACP; M. Jane Black
, BSc, PhD; Leonard L. Wu
, PhD; Rodney J. Dilley
, BSc, PhD; Mark E. Cooper
, MBBS, PhD, FRACP; Colin I. Johnston
, MBBS, FRACP
Широкое применение гематоксилина в микроскопической технике обусловлено его замечательными свойствами как красителя растительного происхождения. Уникальность происхождения и отличительные природные свойства позволяют говорить о незаменимости свойств этого продукта в научных исследованиях и лабораторной диагностике.
Гематоксилин - краситель растительного происхождения, который содержится вформе гликозида в соке кампешевого дерева (Haematoxylon campechianum), произрастающего в Индии и Америке. Родиной же этого дерева является Южная Мексика, область Кампече.Кампешевый экстракт, содержащий гематоксилин, изначально применялся для окраски тканей в текстильной промышленности. В качестве гистологического красителя гематоксилин стал применяться с середины XIX века. Гематоксилин, введенный в микротехнику Вальдейером в 1882 году, положил начало разработке ценнейших методов окраски. Первый рецепт квасцового гематоксилина был предложен Бемером в 1865 году. И в XX веке стал главным красителем, применяемым для окраски ядер клеток.
Химические свойства гематоксилина
Гематоксилин представляет собой бесцветные или слабо окрашенные кристаллы сладкого вкуса, приобретающие под действием света, а также на воздухе красновато-желтую окраску. Гематоксилин малорастворим в холодной воде, но растворим в воде горячей (особенно в присутствии буры), этиловом спирте, глицерине, плохо растворим в диэтиловом эфире. Со щелочами дает растворы пурпурного цвета, который быстро переходит в синевато-фиолетовый, а затем в коричневый. Разбавленные кислоты на гематоксилин не действуют. Обладает свойствами кислотно-основного индикатора. Брутто-формула гематоксилинаС16Н14О6 CAS 517-28-2, а наиболее часто встречающиеся синонимы: Haematoxylin, Hematoxylin, Natural Black 1, C .I. 75290, гидроксибразилин, оксибразилин.
Применение
Сам по себе гематоксилин не представляет пигмента, но при окислении гематоксилина чрезвычайно легко образует пигмент гематеин, который в свою очередь дает различные продукты более глубокого окисления, неприменимые для окрашивания. Все рецепты приготовления гематоксилина для окрашивания препаратов имеют своей целью превращение гематоксилина в гематеин. Но ни гематоксилин, ни гематеин не способны давать окрашивание без протрав, с которыми они образуют солеобразные соединения - лаки. В качестве протрав используют соли алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия. Самыми распространенными протравами являются соединения алюминия (в виде алюмоаммонийных или алюмокалиевых квасцов) или железа (хлорид железа или железоаммонийный квасцы). Другие протравы используются гораздо реже и включают хромовые квасцы и фосфорновольфрамовую кислоту.
Гематоксилин
Гематеин
Растворы гематоксилина
Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, хотя суть всех этих методов заключается в одном - его окислении.
Методы с железным гематоксилином
Существуют два метода окрашивания железным гематоксилином - регрессивный и прогрессивный. Первый основан на избыточном окрашивании и последующей дифференцировке путем отмывания в соответствующей жидкости; при этом соли железа вводят в раствор красителя либо обрабатывают ими срезы перед окрашиванием. Жидкость, служащая для дифференцировки, после окончания процедуры должна быть тщательно отмыта. Если она не отмыта, то продолжает действовать после достижения желательной степени дифференцировки и может испортить окраску.
В прогрессивном методе используют кислые растворы или избыток солей железа, что позволяет избежать переокрашивания.
К методам окрашивания с железным гематоксилином обычно относят:
· Железный гематоксилин Брусси.
· Железный гематоксилин Вейгерта.
· Железный гематоксилин по Ясвоину.
· Железный гематоксилин по Рего.
· Железный триоксигематеин по Ганзену.
· Окраска хлористожелезным гематоксилином по Геквисту.
Методы с квасцовыми гематоксилинами
Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо-аммониевые квасцы. Такие комплексы обычно называются квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Так как красящим началом является гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им “вызреть”. Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3-4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.
Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще в кислых растворах.
К методам окрашивания с квасцовыми гематоксилинами обычно относят:
· Кислый гемалаун Майера.
· Двойная окраска гемалаун-эозином.
· Квасцовый гематоксилин но Эрлиху.
· Окраска гематоксилином Делафильда.
· Окраска квасцовым гематоксилином по Ганзену.
· Квасцовый гематоксилин по Карацци.
Также широкое распространение получили следующие методы:
· Методика окраски срезов с дифференцировкой
· Методика окраски гематоксилин-эозином на предметном стекле.
· Методика проведения окраски парафиновых срезов гематоксилин-эозином по методу Бемера.
· Методика окраски гематоксилин-эозином
Более подробно о вышеперечисленных методах можно прочитать .
Неоднократно предпринимались попытки отыскать более дешевую и удобную замену гематоксилину для применения в микроскопической технике. Предлагали использовать такие природные красители, как сок черники, черной смородины, синтетические красители (антоциан ВВ, феноцианин ТС, галлеин, бразилин, ализариновый синий S, целестиновый синий). Однако ни один из данных заменителей в настоящее время не смог полностью заменить гематоксилин. Во многом поэтому, на сегодняшний день, гематоксилин незаменим в научных исследованиях и лабораторной диагностике.
По материалам статьи Горбуновой Т.К.
«Электронный математический и медико-биологический журнал» . - Т. 7. - Вып. 1. - 2008.
Страница 47 из 68
Окрашивание гематоксилин-эозином (фиксация любая)
Этот метод самый распространенный в гистологической практике, так как благодаря удачному сочетанию красителей, относящихся к двум противоположным группам, позволяет получить общее представление о состоянии исследуемых органов и тканей.
Гематоксилин - природный краситель растительного происхождения, растворимый в воде, спирте и глицерине*.
* Последнее обстоятельство является противопоказанием к заключению в глицерин срезов, окрашенных гематоксилином.
В растворе гематоксилин обладает основными свойствами, благодаря чему хорошо выявляет структурные компоненты ядра, которые содержат нуклеиновые кислоты. Однако красящим свойством обладает не сам гематоксилин, а продукт его окисления -гематеин.
Эозин - искусственный краситель, растворимый в воде или спиртах, обладает кислотными свойствами, окрашивает цитоплазму клеток в розовый цвет.
Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, но суть их одна - его окисление.
Приводим наиболее распространенные рецепты.
Кислый гематоксилин Эрлиха. В 100 мл 96% спирта растворить 2 г гематоксилина, прибавить 100 мл дистиллированной воды, затем 100 мл чистого глицерина, 3 г калийных квасцов (химически чистых) и 10 мл ледяной уксусной кислоты, взболтать и оставить на свету «созревать» в течение 14 дней, периодически взбалтывая. Для того чтобы обеспечить постоянный доступ воздуха (процесс окисления гематоксилина), следует брать широкогорлый сосуд и накрывать входное отверстие несколькими слоями марли. В процессе «созревания» раствор из светло-красного становится темно-красным. В плотно закрытом сосуде краситель сохраняет свойства длительное время.
Гематоксилин Бемера. В 10 мл 100% спирта растворить 1 г кристаллического гематоксилина и добавить 200 мл 10% водного охлажденного и профильтрованного раствора калийных квасцов. Раствор «созревает» на свету в течение 4-5 дней, после чего им можно пользоваться. Перед употреблением раствор красителя каждый раз фильтруют. Со временем он портится.
Кислый гемалаун Майера. В 1000 мл дистиллированной воды растворить 1 г гематоксилина, добавить 0,2 г йодата натрия (NaIО3), 50 г калийных квасцов (химически чистых) и, непрерывно помешивая, дождаться их полного растворения (при этом жидкость приобретает фиолетово-синюю окраску). Затем добавляют 50 г хлоралгидрата и 1 г кристаллической лимонной кислоты, в результате чего раствор становится фиолетово-красным. В хорошо закрытом сосуде из химически чистого стекла краситель хранится длительное время.
Преимущество данного метода - быстрое окисление гематоксилина йодатом натрия, благодаря чему раствор не требует «созревания» и сразу может употребляться для окрашивания.
Приготовление красящего раствора из гематеина: а) 1г фабричного гематеина растворяют в 50 мл 96% спирта (при слабом подогревании); б) 5 г калийных квасцов (химически чистых) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Затем сливают оба раствора, фильтруют и добавляют немного тимола (для консервации). Применяют без «созревания». Раствор хорошо сохраняется в плотно закрытом сосуде.
Приготовление эозина: 0,1 красителя растворяют в 100мл дистиллированной воды.
Перед окрашиванием необходимо подготовить рабочее место, убрать в сторону все лишние предметы, установить микроскоп и освещение к нему, расставить в определенном порядке посуду с соответствующими жидкостями, проверить состояние «батарей» для обезвоживания и просветления препаратов, отфильтровать красящие растворы, подготовить покровные (а если нужно, и предметные) стекла и т. д. Лишь после этого можно приступать к окрашиванию препаратов.
Методика окрашивания. Начинать следует с определения продолжительности, так как она находится в зависимости от способа фиксации, характера и свойств препарата и самих красителей и т. д. Для этого извлекают из дистиллированной воды три стекла со срезами (доведение препаратов до воды - см. предыдущий раздел), удаляют излишки влаги вокруг них (иначе краска растечется по всему стеклу и разбавится водой), кладут в горизонтальном положении и накапывают пипеткой раствор красителя до полного покрытия препарата. Через 2 мин сливают красящий раствор* с одного из стекол и помещают его в дистиллированную воду (для отмывания излишков красителя). Два оставшихся стекла освобождают от гематоксилина через 4-6 мин соответственно. После этого, вытерев тыльную сторону стекла, препарат рассматривают при малом увеличении микроскопа (если нужно, то и при большом, накрыв препарат покровным стеклом). При окраске свободноплавающих срезов с помощью крючочков переносят несколько срезов в краситель, налитый на часовое стекло или в низкий бюкс, а затем через такие же промежутки времени извлекают, промывают в дистиллированной воде, расправляют на чистом предметном стекле и рассматривают в микроскоп.
Возможные варианты результатов: а) ядра окрашены в светло-фиолетовый цвет без четкого различия микроструктур - препарат недокраш е н; б) ядра темно-фиолетовые (почти черные, но с красноватым оттенком), структурные элементы расплывчаты, цитоплазма тоже окрашена - препарат перекрашен; в) ядра красно-фиолетовые с отчетливо выраженными ядрышком и хроматином, цитоплазма светлая, неокрашена - окраска нормальная.
* Краситель сливают в сосуд, откуда его брали, так как он пригоден к дальнейшему употреблению.
Установив оптимальное время окрашивания гематоксилином, в течение 3-5 мин отмывают излишки красителя в дистиллированной воде и затем помещают препараты в водопроводную воду, где они находятся до приобретения синей окраски (10-14 мин) вследствие посинения ядер в слабощелочной среде (водопроводную воду можно заменить дистиллированной, слегка подщелочив ее аммиаком). После этого препарат вновь помещают на 3-5 мин в дистиллированную воду.
Помимо изложенного выше прогрессивного метода окраски ядер гематоксилином, существует регрессивный метод. Срез с перекрашенными ядрами после промывания в дистиллированной воде помещают на 1-6 с в подкисленный 70° спирт (5-7 капель крепкой хлористоводородной кислоты на 100 мл спирта) и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски (ослабевает фиолетовый и усиливается красноватый тон ядер). Дальнейшая обработка обычная.
Окраску ядер гематеином и кислым гемалауном Майера производят таким же способом, но необходимо особенно тщательно промыть препарат, так как неудаленный остаток кислоты может нарушить окраску.
По окончании промывки окрашенного гематоксилином препарата в дистиллированной воде его вновь извлекают, удаляют излишнюю влагу и накапывают раствор эозина. Время окраски также подбирают опытным путем, варьируя экспозицию от 1 до 4-5 мин.
Возможные варианты: а) окрашенная цитоплазма и внеклеточные образования имеют едва заметный розоватый или желтоватый оттенок - препарат недокрашен; б) общий фон интенсивно красного цвета, микроструктуры видны нечетко, граница ядер расплывчата - препарат перекрашен; в) общий фон умеренно розовато-желтого цвета, ядра четко контурируются - окраска удачная.
После того как окрашивание эозином закончено, краситель сливают обратно во флакон (как и гематоксилин, он может употребляться многократно), препарат ополаскивают в дистиллированной воде, проводят через спирты восходящей концентрации, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Следует знать, что эозин легко вымывается в воде и спиртах низкой концентрации, поэтому проводить препарат через эти жидкости следует быстро, лишь окунув несколько раз, и только в 96% и 100% спирте можно держать 1-2 мин. Если препарат перекрашен эозином, то излишнюю окраску следует удалить, увеличив время промывания (в дистиллированной воде) и проведения через слабые спирты.
Для усиления красящих свойств эозина применяют подкисление раствора красителя уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл красителя).
Помимо описанного двойного метода обзорной окраски препаратов, применяются и другие.
Существуют красители, окрашивающие ядра в красный цвет (сафранин, квасцовый кармин), а цитоплазму - в зеленый (световой зеленый), оранжевый (оранжевый Г).
Окрашивание железным гематоксилином по Гейденгайну
(фиксация любая, но наилучшие результаты после сулемовых и хромовых фиксаторов)
Железный гематоксилин в отличие от приведенных выше гематоксилиновых растворов окрашивает не только ядра, но и различные цитоплазматические и некоторые межклеточные структуры. Это свойство основано на том, что перед окрашиванием препарат протравливают в растворе железоаммониевых квасцов, которые по-разному воспринимаются различными тканевыми элементами. Последующая обработка протравленных тканей гематоксилиновым раствором приводит к образованию черного железно-гематеинового лака, который в процессе дифференцировки срезов частично уходит из тканей обратно в раствор. Таким образом, по типу окрашивания железный гематоксилин - типичный регрессивный краситель.
Из сказанного следует, что, варьируя время протравливания, окрашивания и дифференцировки, можно получать различный конечный эффект в зависимости от целей исследования (выявить только ядерные структуры или одновременно цитоплазматические и внеклеточные образования).
Приготовление растворов. 1. Раствор железоаммониевых квасцов. Растворить 10 г железоаммониевых квасцов (сульфат аммиака-железа) в 100мл дистиллированной воды. Можно употреблять только светло-фиолетовые кристаллы. Желтые, зеленоватые, беловатые кристаллы применять не следует.
- Раствор гематоксилина. Растворить 1 г гематоксилина в 10 мл 96% спирта и разбавить дистиллированной водой до 100 мл, отметив уровень жидкости в сосуде, затем оставить для «созревания» на 4-5 нед, обеспечив постоянный доступ света и воздуха (для этого горлышко сосуда надо прикрыть сложенной в несколько слоев марлей и по мере испарения доливать воду до исходного уровня). В процессе созревания раствор меняет светло-коричневую окраску на темно-коричневую. Перед употреблением раствор разбавляют равным количеством дистиллированной воды.
Если нужно обеспечить быстрое приготовление раствора гематоксилина (без созревания), то к раствору, приготовленному по описанному выше рецепту, добавляют 0,1 г йодата натрия (NaIО3), который быстро окисляет гематоксилин в гематеин и делает краситель пригодным к употреблению через 1 ч после приготовления.
Проведение окрашивания. Предварительная обработка. Находящиеся в дистиллированной воде срезы переносят в 2,5% раствор железоаммониевых квасцов (приготовленный путем разбавления дистиллированной водой исходного 10% раствора) и оставляют на 3-12 ч.
Процесс протравливания можно значительно ускорить (до 1-3 мин), поместив сосуд со срезами в термостат при 37°С. По окончании протравливания раствор сохраняют.
Окрашивание. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы помещают в разбавленный (вдвое) раствор гематоксилина на 1-36 ч, до полного почернения (лучше перекрасить, чем недокрасить). Как и при протравливании, время окраски можно сократить (до 2-3 ч - 30 мин) путем помещения сосуда с красящимися срезами в термостат при 37°С.
Дифференцировка. Это самый ответственный этап окрашивания. Окрашенные срезы тщательно отмывают в двух-трех порциях дистиллированной воды (7- 10 мин) и помещают в раствор железоаммониевых квасцов, служивший для протравливания. Степень дифференцировки периодически контролируют в микроскоп. Для этого срез ополаскивают в дистиллированной воде и рассматривают при нужном увеличении (вплоть до водной иммерсии, накрыв предварительно покровным стеклом). Если процесс дифференцировки идет быстро, то следует уменьшить концентрацию раствора железоаммониевых квасцов, разбавив его дистиллированной водой.
Получив окраску нужной степени, срезы тщательно промывают в проточной или часто сменяемой водопроводной воде в течение 10-12 мин (недостаточное отмывание дифференцирующей жидкости приводит к обесцвечиванию препаратов), затем ополаскивают в дистиллированной воде, обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.
Быстрый метод окрашивания железным гематоксилином по Гурвичу
В случае необходимости срочного окрашивания срезов железным гематоксилином Гейденгайна применяют у скоренный метод Гурвича (реактивы те же).
Вынув стекло со срезами из дистиллированной воды, промокают срез гладкой фильтровальной бумагой и покрывают 2,5% раствором железоаммониевых квасцов. Затем тыльную сторону стекла подогревают над спиртовкой до образования пара (не перегревать!) и, дав немного остыть, повторяют процедуру нагревания еще 2-3 раза. После этого сливают квасцы, не промывая срез, накапывают гематоксилин и вновь подогревают до появления паров. Окраску ведут до тех пор, пока срез не приобретает сине-черный цвет. Затем его промывают в дистиллированной воде, заливают квасцами и следят за ходом дифференцировки в микроскоп. По окончании дифференцировки срез тщательно отмывают от квасцов (в двух-трех сменах дистиллированной воды, а затем в проточной), обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам. При работе со свободноплавающими срезами рекомендуется предварительно наклеить их на предметное стекло сразу же по извлечении из воды и вести окраску, как описано. Обработка срезов в свободноплавающем состоянии может дать неравномерную окраску.
Общие замечания. Приведенное выше описание протравливания, окраски и дифференцировки зависит от многих факторов (качество реактивов, свойство изучаемого объекта, цели и задачи исследования и т. д.) и устанавливается опытным путем в каждом конкретном случае. Наиболее ответственным этапом окрашивания является дифференцировка, так как отдельные структурные компоненты клеток и тканей с различной скоростью отдают обратно накопленный краситель. Быстрее всех обесцвечивается гомогенная часть цитоплазмы, затем ее гранулярные компоненты и в последнюю очередь структурные элементы ядра.
При работе с целлоидиновыми срезами следует предварительно освободить препарат от целлоидина (см. соответствующий раздел), так как он значительно подкрашивается железным гематоксилином и не обесцвечивается при дифференцировке. Растворение целлоидина следует производить до протравливания в железоаммониевых квасцах, так как после него растворимость значительно ухудшается.
Этикетирование предметных стекол
После наклейки срезов (или непосредственно перед ней) на предметное стекло необходимо нанести соответствующие обозначения. Особенно это важно при серийных срезах и при обработке экспериментального материала. Конкретное содержание пометок зависит от характера исследования и от установок, принятых в той или иной лаборатории. Наиболее надежный способ - выцарапывание знаков специальными карандашами с наконечниками из твердых сплавов типа «победит». Менее надежны надписи тушью. Существуют различные приемы, чтобы тушь при обработке в жидких средах не смывалась и не размазывалась: а) до наклеивания срезов один из концов предметного стекла, смазанный белком с глицерином, нагревают над огнем до появления дыма, после охлаждения наносят на данный участок необходимые обозначения и снова прогревают над пламенем; б) наносят соответствующую надпись, а затем опускают эту часть стекла в 1-2% раствор целлоидина для образования защитной пленки и т. д.
Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей
Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.).
Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.
Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем- цитоплазма.
Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.
Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.
Гематоксилин Эрлиха.
Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином.
Железный гематоксилин Гейденгайна
окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.
Железный гематоксилин Вейгерта
готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта 1 и раствора Вейгерта 2. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта 2 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официальный раствор полуторахлористого железа-это 50% раствор водного хлорного железа (FеСI3* 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором соляной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.
Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания -0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Кислые красители.
Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.
Методика окрашивания срезов гематоксилин - эозином.
Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.
Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:
1) срезы переносят в дистиллированную воду;
2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;
3) промывают в дистиллированной воде;
4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;
5) осуществляют контроль под микроскопом;
6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;
7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;
8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);
9) промывают в дистиллированной воде;
10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;
11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;
12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.